นักวิจัยได้ทำการทดลองการแยกเชื้อซาร์เบโคไวรัสของค้างคาวโดยใช้ ค้างคาว Rhinolophus cornutus  จากหลายภูมิภาคในญี่ปุ่น ซึ่งจัดอยู่ในกลุ่มไวรัสกลุ่มเดียวกันที่เกี่ยวข้องกับโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV-2) บาคาร่า

เบต้าโคโรนาไวรัส ในมนุษย์ (β-CoVs) ที่ทำให้เกิดโรคสูง เช่น โคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS-CoV), SARS-CoV-2 และกลุ่มอาการทางเดินหายใจตะวันออกกลาง (MERS-CoV) ได้รับการพิจารณาว่ามีต้นกำเนิดจากค้างคาว ดังนั้น การเฝ้าระวัง β-CoV ของค้างคาวจึงมีความสำคัญในการปรับปรุงความเข้าใจและประเมินศักยภาพของการรั่วไหลของ β-CoV ในมนุษย์ Sarbecoviruses ที่ระบุในประเทศแถบเอเชีย เช่น จีน มีรายงานว่ามีความหลากหลายทางพันธุกรรม อย่างไรก็ตาม การแปรผันทางพันธุกรรมและการแพร่กระจายของไวรัสซาร์เบโคของค้างคาวในญี่ปุ่นยังไม่มีลักษณะเฉพาะที่ชัดเจนและจำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม ผู้เขียนของการศึกษานี้ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าไวรัส VSV (vesicular stomatitis virus) ซึ่งเป็นไวรัสเทียมที่ประกอบด้วยโปรตีน S (spike) ของ Rc-o319 sarbecovirus จาก  R. cornutusที่ติดเชื้อ Rc-ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) เท่านั้นที่แสดงออก เซลล์ แต่ไม่ใช่เซลล์ที่แสดง ACE2 (hACE2) ของมนุษย์หรือ  Rhinolophus  ACE2 – แสดงเซลล์อื่นๆ

ในการศึกษาครั้งนี้ นักวิจัยรายงานเกี่ยวกับการจำแนก การแยกตัว และลักษณะทางชีวภาพและพันธุกรรมของซาร์เบโคไวรัสที่มีต้นกำเนิดจากค้างคาวในสถานที่ต่างๆ ของญี่ปุ่น ตัวอย่างอุจจาระได้มาจากค้างคาว สายพันธุ์ R. ferrumequinum และR. cornutus  ในจังหวัดชิบะ ชิซูโอกะ และนีงะตะ ดำเนินการ RT-PCR แบบเรียลไทม์ (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบย้อนกลับ) และทีมได้สร้างเซลล์ Vero ที่แสดงออก RcACE2 (Vero-RcACE2) โดยอาศัยเซลล์ Vero/transmembrane protease s erine 2 (TMPRSS2)  

การวิเคราะห์หาลำดับถัดไป (NGS) ดำเนินการเพื่อหาลำดับจีโนมทั้งหมดของไวรัสที่แยกได้ทั้งหมด และลำดับนั้นถูกฝากไว้ใน GenBank นอกจากนี้ การวิเคราะห์พล็อตความคล้ายคลึงกันได้ดำเนินการสำหรับลำดับจีโนมทั้งหมดโดยใช้ทุกไอโซเลตเป็นแบบสอบถาม ต้นไม้สายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นจาก sarbecoviruses ของค้างคาวในญี่ปุ่นโดยอาศัยลำดับจีโนมทั้งหมดด้วยการวิเคราะห์ความเป็นไปได้สูงสุดและการจำลองแบบบูตสแตรป S RBM (แม่ลายการจับตัวรับ) ของค้างคาวที่แยกได้จากประเทศญี่ปุ่นนั้นมีความสอดคล้องกับไวรัสซาร์เบโคตัวอื่นๆ สำหรับการประเมินจลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของ sarbecovirus ที่แยกได้จากค้างคาวในญี่ปุ่น ค้างคาวR. cornutus  ที่แยกได้ Rc-os20, Rc-o319, Rc-mk2 และ Rc-kw8 หรือ SARS-CoV-2 (สายพันธุ์ B.1.1.7) ได้รับการฉีดวัคซีน เข้าไปในเซลล์ Vero-RcACE2 [RcACE2, Vero/TMPRSS2 (WT)], Vero-hACE2 (hACE2) หรือ Vero-ACE2KO (ACE2KO) และระดับของไวรัสโดยใช้การตรวจคราบจุลินทรีย์ คาสิโน

เชื้อที่แยกได้แสดงการเติบโตอย่างมีประสิทธิภาพในเซลล์ที่แสดงออกถึงRhinolophus cornutus  ACE2 แต่เติบโตได้ไม่ดีในเซลล์ที่แสดงออกถึง hACE2 ซึ่งบ่งชี้ว่าค้างคาวที่แยกได้นั้นมีโฮสต์ที่จำกัด การวิเคราะห์ RT-PCR ช่วยให้สามารถตรวจจับลำดับยีนซองจดหมาย (E) ของซาร์เบโคไวรัสได้สำเร็จใน ตัวอย่าง Rhinolophus cornutus หนึ่งหรือสองตัว  ในทุกจังหวัด ประสบความสำเร็จในการแยกไวรัสซาร์เบโคของค้างคาวโดยใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์ Vero-RcACE2 ซึ่งมีผลทางไซโตพาทิกมหาศาลและการก่อตัวของซิงค์ซีเทียมจากตัวอย่างอุจจาระค้างคาวที่มี RT-PCR จากทุกจังหวัด

ค้างคาวที่แยกได้จากจังหวัดชิซูโอกะ นีงะตะ และชิบะได้รับการออกแบบเป็น Rc-kw8, Rc-os20 และ Rc-mk2 ตามลำดับ นอกจากนี้ Rc-o319 ถูกแยกได้โดยใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์ Vero-RcACE2 ในทางตรงกันข้ามตัวอย่างทั้งหมดของสายพันธุ์ Rhinolophus ferremuquinum  มีค่าเป็นลบ ซึ่งบ่งชี้ว่าไวรัสซาร์เบโคของค้างคาวกระจายอยู่ใน  ค้างคาว Rhinolophus cornutus  ในญี่ปุ่น ลำดับจากสายพันธุ์ค้างคาวทั้งหมดที่แยกได้จากประเทศญี่ปุ่นมีความคล้ายคลึงกันสูง (อยู่ระหว่าง 95% ถึง 97%) อย่างไรก็ตาม Rc-os20 และ Rc-mk2 ไม่มีการเข้ารหัสภูมิภาคสำหรับ ORF8 (เปิดเฟรมการอ่าน 8)

ทีมสังเกตเห็นความคล้ายคลึงกันสูงระหว่างค้างคาวที่แยกได้ตลอดทั้งลำดับจีโนม ยกเว้นไซต์ที่เขียนโค้ดสำหรับโดเมนตัวรับยีน S (RBD) และโดเมน N-terminal (NTD) อย่างไรก็ตาม พบว่า Rc-kw8 และ Rc-o319 NTDs ถูกอนุรักษ์ไว้ ไม่พบการรวมกันใหม่ที่มีนัยสำคัญระหว่างค้างคาวที่แยกได้ ในการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ ตรวจพบเชื้อที่แยกได้ในกลุ่มพันธุกรรมหนึ่งกลุ่มที่อยู่ในกลุ่มพันธุกรรมที่ประกอบด้วยซาร์เบโคไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ SARS-CoV-2

ผลการวิเคราะห์ Phylogenetic S RBD ระบุว่าเชื้อที่แยกได้จากประเทศญี่ปุ่นอยู่ในกลุ่มพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตในไวรัสที่ใช้ ACE2 ortholog โมเลกุลเป็นตัวรับ ดังนั้น ทีมงานจึงสันนิษฐานว่าสายพันธุ์ใหม่ที่แยกได้จากประเทศญี่ปุ่นใช้ RcACE2 เป็นตัวรับ ค้างคาวแยกตัวจำลองได้อย่างมีประสิทธิภาพเฉพาะในเซลล์ Vero-RcACE2 แต่ไม่อยู่ในเซลล์ Vero-ACE2KO, Vero/TMPRSS2 หรือ Vero-hACE2 ผลการวิจัยระบุว่าค้างคาวที่แยกตัวได้ขึ้นอยู่กับ RcACE2 สำหรับการติดเชื้อ

ในทางตรงกันข้าม SARS-CoV-2 แสดงการจำลองแบบที่มีประสิทธิภาพในเซลล์ Vero-RcACE2, Vero-hACE2 และเซลล์ Vero/TMPRSS2 แต่ไม่สามารถจำลองแบบได้ดีในการเพาะเลี้ยงเซลล์ Vero-ACE2KO ซึ่งบ่งชี้ว่าการติดเชื้อขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของตัวรับ ACE2 หลายตัว รวมทั้ง   ค้างคาวRhinolophus cornutus ผลการวิจัยระบุว่าค้างคาวที่แยกจากญี่ปุ่นใช้ bRcACE2 เป็นตัวรับเท่านั้น ลำดับจีโนมส่วนใหญ่ของสายพันธุ์จากญี่ปุ่นได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดี ซึ่งอาจจะเป็นตั้งแต่Rhinolophus  spp. ค้างคาวชนิดต่างๆ อพยพไปยังระยะทางที่ค่อนข้างสั้นและมักไม่ติดต่อข้ามกับค้างคาวกลุ่มอื่น ข้อยกเว้นคือภูมิภาค S ที่เขียนรหัสสำหรับ RBD และ NTD ซึ่งแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมอย่างกว้างขวางเนื่องจากแรงกดดันทางภูมิคุ้มกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าค้างคาวเหล่านี้แยกจากความเครียดจากบรรพบุรุษในช่วงเวลาที่ผ่านมา

โดยรวมแล้ว ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าค้างคาวที่แยกได้นั้นใช้ batACE2 ในรูปแบบของตัวรับที่ไม่มีการจำลองแบบในเซลล์ที่แสดง hACE2 ดังนั้นจึงเป็นลักษณะเฉพาะและบ่งชี้ถึงศักยภาพในการติดเชื้อของมนุษย์ที่หายาก Sarbecoviruses อาจกลายพันธุ์และนำไปสู่การติดเชื้อในมนุษย์ผ่านสายพันธุ์โฮสต์ระดับกลางในปศุสัตว์หรือสัตว์ป่า ดังนั้น การศึกษาระบาดวิทยาของซาร์เบโคไวรัสในสัตว์ป่า รวมทั้งค้างคาว จะต้องดำเนินการด้วยการประเมินความเสี่ยงระยะยาวของศักยภาพในการแพร่เชื้อจากสัตว์สู่คน